病毒載體在神經中的應用

病毒載體簡介和特性

病毒載體是分子生物學家常用的、能將遺傳物質導入細胞中的工具，可以在體內或者體外應用。病毒已經進化出專門的分子機制，從而能有效地將它們的遺傳物質導入到被感染的細胞內。分子生物學家第一次利用這種機制是在二十世紀七十年代，Paul Berg使用了含λ噬菌體DNA、且經過改造的SV40病毒感染猴子腎臟的培養細胞。現在，病毒載體廣泛應用于各個領域的基礎研究、精準的基因治療、疫苗的開發等。病毒載體一般具備以下幾個特點：

1.  安全性：雖然有些病毒載體來源于致病性病毒，但是目前使用的病毒載體都經過改造，盡可能地降低危害增加安全性。通常的改造方法是刪除病毒基因組中對于病毒復制至關重要的部分，這樣病毒可以有效地感染細胞，但是如果要復制產生新的病毒，則需要提供被刪除的部分；

2.  毒性低：在使用病毒載體時，要保證病毒對于被感染細胞的生理功能的影響很小；

3.  穩定性：有一些病毒，它們的基因組不穩定，能迅速發生重組，這對于實驗的可預料性和可重復性很不利，因此要盡可能地避免使用這類病毒；

4.  標記基因：病毒載體中一般包含幾個特殊的基因，這幾個基因能幫助確認哪些細胞被病毒感染，此類基因被稱為標記基因。

病毒載體在神經系統中的應用

在神經系統的研究中，比較常用的病毒有腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒和腺相關病毒（adenovirus-associated virus, AAV），這四種病毒載體的基本特性如表一所示。

由于腺病毒免疫反應比較強，并且表達持續時間比較短（一般是7-10天），現在在神經系統中科學家較少使用腺病毒載體。慢病毒可以實現高效的體外（in vitro）、體內（in vivo）感染，當有實驗需要用同一個病毒同時進行體內、體外實驗時，慢病毒是非常好的選擇，而且慢病毒表達的起始時間很短（3-4天）、表達持續時間也比較長。由于逆轉錄病毒載體只感染分裂細胞，并且表達持續時間也比較長，因此被廣泛應用于神經干細胞的研究。而AAV載體由于整合方式安全（低頻整合到“安全”位點）、滴度超高和表達持續時間非常長，特別適合于體內研究。神經系統中病毒載體應用參考信息如表二所示。

神經系統的基因功能研究策略

在神經系統中進行基因功能研究時，主要的策略有以下幾種：

1）  質粒轉染，即將質粒直接轉入神經細胞內。對于體內的神經細胞，使用的方法有胚胎電轉（in uteroeletroporation）、iontoporation；而對于體外培養的神經細胞，使用的方法有電轉、鈣轉、脂質體轉染（如lipofectamine 2000）等。但是這些方法存在操作難度較大、效率低、毒性大、只能對非成熟神經元操作以及導入的基因表達時間短等缺點；

2）  轉基因動物。隨著Cre-loxP 等基因操作技術的豐富以及轉基因動物種類的擴大，現在很多課題組采用轉基因動物的方式進行基因功能研究。使用轉基因動物的優點在于基因操作的結果穩定可靠，而使用轉基因動物的缺點在于成本高、動物的交配飼養耗時耗力、實驗過程比較長，因此使得很多課題組不敢輕易進行嘗試；

3）  病毒載體工具。病毒載體由于制作過程相對簡單、成本不高、基因能穩定長時間表達等優點而得到了廣泛應用。在神經系統中，無論是體內或者體外，病毒載體既可以導入內源或者外源基因進行表達，又可以導入與內源基因mRNA配對的shRNA進行干擾實驗；

4）  轉基因動物結合病毒載體工具。現在除了單單使用轉基因動物或者病毒載體進行基因功能研究之外，還有一種使用非常廣泛的策略，那就是將轉基因動物和病毒載體工具結合使用。例如使用Cre-loxP系統進行基因敲除操作時，可以將Cre病毒通過立體定位注射的方式注射到loxP動物腦內，從而實現非常精準的區域和組織特異性，而且可以控制基因敲除的時間；而如果使用Cre-loxP系統進行基因表達實驗，可以將病毒（包含熒光蛋白、光遺傳通道蛋白、化學遺傳學蛋白等）注射進入Cre轉基因小鼠里面，在組織特異性啟動子的驅動下，使得蛋白特異性表達在某類神經元里。CRISPR-Cas9系統作為當今世界上最“火熱”的基因組編輯技術，現在可以通過病毒和轉基因動物結合的方式進行操作。在2014年，MIT的張鋒實驗室成功制作出Cre-dependent Rosa26 Cas9 Knockin小鼠（簡稱Cas9小鼠），這樣科學家可以將Cas9小鼠和病毒結合，能非常方便地實現在特定區域內的某一種類細胞中同時敲除多個基因的目的（如圖1A ），也可以將Cas9小鼠和Cre轉基因小鼠交配，然后注射sgRNA到后代小鼠腦內實現基因組編輯的目的（如圖1B）。

表一. 神經系統中常用病毒載體的基本特性

基因容量是在考慮常用啟動子及必要表達元件基礎上計算的

表二. 神經系統中病毒載體應用參考信息

圖1. CRISPR-Cas9系統中，將轉基因小鼠和病毒結合使用的策略