神經元原代培養和病毒感染操作指南

原代神經元培養步驟（以海馬為例）

1.  取胚胎期第18天（E18）的孕鼠（小鼠的cell culture可取P0-P1的新生鼠，冰上麻醉），用乙醚或者異氟烷混合氣體麻醉（注意：最好不要腹腔注射水合氯醛或者戊巴比妥鈉進行麻醉，因為腹腔注射對胎鼠影響較大）；

2.  在冰上迅速破腹取出胎鼠；

3.  將胎鼠的頭剪下放在冰的dissection medium里；

4.  剝去皮膚組織和顱骨，將大腦連接小腦一起取出放在另一個裝有冰的dissection medium的dish中；

5.  將dish放在冰上，將大腦分割成兩半，分割時在與小腦連接的腹側基部斷開，這樣便于暴露海馬；

6.  撥去腦膜，用小剪刀將海馬剪出。由于皮層細胞較多，此時可將接近小腦的那些皮層組織夾去（注意：不要用鑷子擠捏腦組織，這樣會造成大面積細胞死亡，不利于后續的培養）；

7.  在dish中將組織用小剪刀減碎；

8.  吸取含有組織碎塊的dissection medium至5ul的epp管中；

9.  靜置一段時間，待組織碎塊沉降至底部后吸取上清（不需要吸的很干凈）；

10.  在另一個5ml的epp管中按照trysin：DNA酶：digestion solution=1：1：3的體積比混合，用過濾器過濾后加入組織塊中；

11.  在37度消化7-8分鐘，最長不要 超過15分鐘（消化時間根據酶的濃度確定），每2分鐘混勻一下；

12.  此時可以在5ml的epp管中準備trysin inhibitor (TI)：dissection medium=1：4的混合液（也可以用5%FBS+Neurobasal+B27代替），在預先coating的dish中加入一定量的5%5%FBS+Neurobasal+B27混合液；

13.  將消化的組織塊從37度中取出、離心，也可自然沉降，吸取上面多余的液體后，加入第12步的混合液中止消化，37度靜置2-3分鐘；

14.  以下步驟要求在冰上完成。靜置，待組織塊沉到底或者離心后，吸走上清液，然后加入DNA酶（可用dissection medium稀釋），吹打；

15.  離心5-6分鐘，吸走上清；

16.  加入2-3ml的dissection medium后，用移液器或者吸管將碎組織塊吹散；

17.  10倍稀釋后計數（10ul懸浮液+90ul臺盼藍）；

18.  按照要求濃度鋪板，然后充分混勻；

注意：一般一只小鼠的腦子可以取得2 x107-3x107個神經元，體外培養3-9天的神經元均可以被慢病毒感染。

病毒感染原代神經元操作步驟

1.  病毒感染前，先吸取一半舊的培養基留作換液時使用，然后按照MOI=5-20的參數加入慢病毒濃縮液或者按照MOI=104-105加入AAV病毒，輕輕混勻放入培養箱中；

2.  慢病毒感染8-12小時，輕輕吸出培養基，注意不能吸干導致神經元遭受空氣氧化損傷，然后迅速將已經預熱好的、感染前收集的舊培養基加入；

3.  繼續培養2-3天后，熒光顯微鏡夏觀察陽性對照GFP慢病毒感染組的感染情況，一般80%以上的神經元均為陽性；

4.  3天以后的神經元可以根據實驗設計進行后續工作，如western blot、qPCR、免疫組化和電生理實驗等。

注意事項

1）  病毒感染之前需要先觀察神經元形態，保證神經元狀態較好的前提下，然后給予病毒進行感染處理；

2）  神經元原代培養的狀態非常重要，否則慢病毒會造成較多神經元死亡。另外，由于原代培養神經元較為脆弱，因為無論使用AAV還是慢病毒感染顆粒進行實驗，都不建議加入polybrene增強感染。

圖1.用慢病毒感染培養的海馬神經元進行基因敲減實驗（Dittgen et al. 10.1073/pnas.0407976101）

圖2.用不同亞型的AAV病毒感染培養的皮層神經元

（Virology. 2008 March 1; 372(1): 24–34. doi:10.1016/j.virol.2007.10.007）